СОДЕРЖАНИЕ
НАЗНАЧЕНИЕ 3
ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА 3
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 3
СОСТАВ НАБОРА 4
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 4
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ 4
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА 4
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 5
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 5
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ И НОРМЫ 7
CONTENT
1. INTENDED USE 8
2. SUMMARY AND EXPLANATION 8
3. PRINCIPLE OF THE TEST 8
4. WARNINGS AND PRECAUTIONS 8
5. KIT COMPONENTS 8
6. SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE. 9
7. TEST PROCEDURE 10
8. QUALITY CONTROL 11
9. CALCULATION OF RESULTS 11
10. EXPECTED VALUES 12
11. PERFORMANCE CHARACTERISTICS 12
_______________________________________________________________________________________________________
Инструкция составлена Руководителем службы клиентского сервиса ООО «ХЕМА», к. б. н. Д. С. Кострикиным
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВИНОГО МЯСА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ «СВИНИНА-ИФА»
НАЗНАЧЕНИЕ
1.1. Набор реагентов «СВИНИНА-ИФА» предназначен для количественного определения концентрации свиного мяса в пищевых продуктах методом твердофазного иммуноферментного анализа.
1.2. Мясо свиньи запрещено к употреблению религиозными конфессиями, а в некоторых странах также законом. Свинина также может являться причиной аллергии. С помощью пары высокоспецифичных антител возможно определение следовых количеств антигенов свиного мяса. Тест определяет с практически одинаковой чувствительностью сырое свиное мясо, полуфабрикаты на его основе, а также мясо, прошедшее любую кулинарную обработку, включая варку, жарку, тушение, копчение.
ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА
Определение свиного мяса основано на использовании «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа. На внутренней поверхности лунок планшета иммобилизованы антитела против антигена свиного мяса. Антиген из образца связываются с антителами на поверхности лунки. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью конъюгата антител к другому эпитопу антигена свиного мяса с пероксидазой хрена. В результате образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Во время инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) происходит окрашивание растворов в лунках. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации свиного мяса в исследуемом образце. Концентрацию свиного мяса в исследуемых образцах определяют по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания свиного мяса в калибровочных пробах.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
3.1. Специфичность.
Использование моноклональных антител против антигена скелетной мышцы свиньи (тропомиозинового комплекса) обеспечивает высокую специфичность анализа. Набор не определяет антигенов мяса следующих видов: корова, овца, антилопа, лошадь, лось, олень, курица, индейка, утка, гусь, кролик, грызуны и нечувствителен к следам крови человека.
На момент составления данной версии Инструкции нет данных о специфичности данной тест-системы по отношению к мясу верблюда и кенгуру. ВНИМАНИЕ: данный Набор непригоден для определения следов сердечной и гладкой мускулатуры, жировой ткани и кожи (шкурки) свиньи; данные материалы могут давать положительный результат только в случае попадания фрагментов поперечно-полосатой (скелетной) мышечной ткани.
Рыбы
Курица
Индейка
Гусь
Утка
Страус
Лягушка
|
<0.1%
|
Корова (говядина)
Овца (баранина)
Олень
Кролик
|
<0.5%
|
Мясо лося
Лошадь (конина)
|
<1%
|
3.2. Воспроизводимость.
Коэффициент вариации результатов определения содержания свиного мяса в одном и том же образце пищевых продуктов с использованием Набора «СВИНИНА-ИФА» не превышает 8,0%.
3.3. Линейность.
Зависимость концентрации антигена свиного мяса в образцах при разведении их ИФА -буфером, имеет линейный характер в диапазоне концентраций 10-300 Ед/мл и составляет ±10%.
3.4. Точность.
Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» – соответствие измеренной концентрации антигена свиного мяса предписанной, полученной путем смешивания равных объемов калибровочных проб 30 и 100 Ед/мл. Процент «открытия» составляет 90-110%.
3.5. Чувствительность.
Минимальная достоверно определяемая Набором «СВИНИНА-ИФА» концентрация свиного мяса в пищевых продуктах не превышает 5 Ед/мл готового экстракта (см. раздел «Подготовка различных типов исследуемых образцов»). По данным предварительного биохимического анализа это составляет около 25 нг/мл «целевого» белка-антигена свиного мяса. Вместе с тем иммунореактивность «целевого» белка значительно вариирует в зависимости от его сохранности в исследуемом материале и от состава самого материала, поэтому результат рекомендуется выдавать не в весовых, а в условных Единицах.
.
СОСТАВ НАБОРА
|
Код компонента
|
Символ
|
Наименование
|
Количество
|
Ед.
|
Описание
|
1
|
P366Z
|
SORB MTP
|
Планшет 96-луночный полистироловый, стрипированный, готов к использованию
|
1
|
шт
|
-
|
2
|
C366Z
|
CAL 1 - 5
|
Калибровочные пробы на основе трис-буфера (рН 7.2-7.4), содержащие известные количества свиного мяса - 0; 10; 30; 100; 300 Ед/мл, готовы к использованию (по 0.8 мл каждая)
|
5
|
шт
|
прозрачные жидкости красного цвета (калибровочная проба 0 - прозрачная бесцветная жидкость)
|
3
|
T366Z
|
CONJ HRP
|
Конъюгат, готов к использованию (11 мл)
|
1
|
шт
|
прозрачная жидкость красного цвета
|
4
|
S014Z
|
DIL
|
ИФА-Буфер, готов к использованию (11 мл)
|
1
|
шт
|
прозрачная жидкость синего цвета
|
5
|
R055Z
|
SUBS TMB
|
Раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ), готов к использованию (11 мл)
|
1
|
шт
|
прозрачная бесцветная жидкость
|
6
|
S008Z
|
BUF WASH 21X
|
Концентрат отмывочного раствора, 21х-кратный (22 мл)
|
1
|
шт
|
прозрачная бесцветная жидкость
|
7
|
R050Z
|
STOP
|
Стоп-реагент, готов к использованию (11 мл)
|
1
|
шт
|
прозрачная бесцветная жидкость
|
8
|
N003
|
-
|
Бумага для заклеивания планшета
|
2
|
шт
|
-
|
9
|
K366I
|
-
|
Инструкция по применению Набора реагентов «СВИНИНА-ИФА»
|
1
|
шт
|
-
|
10
|
K366Q
|
-
|
Паспорт контроля качества Набора реагентов «СВИНИНА-ИФА»
|
1
|
шт
|
-
|
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
5.1. Потенциальный риск применения Набора – класс 1
5.2. Все компоненты Набора, за исключением стоп-реагента (5,0% раствор серной кислоты), в используемых концентрациях являются нетоксичными.
Раствор серной кислоты обладает раздражающим действием. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. При попадании на кожу и слизистые пораженный участок следует промыть большим количеством проточной воды.
5.3. При работе с Набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).
5.4. При работе с Набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ
- фотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;
- дозаторы со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы в диапазоне 25-250 мкл;
- цилиндр мерный вместимостью 500 мл;
- бумага фильтровальная
- лабораторные весы с точностью измерения 0,1 грамм (для работы с мясопродуктами)
- острый одноразовый инструмент для измельчения образцов мяса
- Консервант для образцов, кат.№ S075Z (необязательно)
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА
7.1. Перед проведением анализа компоненты Набора и исследуемые образцы следует выдержать при комнатной температуре (+18-25 °С) не менее 30 мин
7.2. Приготовление планшета.
Вскрыть пакет с планшетом и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся неиспользованными стрипы, чтобы предотвратить воздействие на них влаги, тщательно заклеить бумагой для заклеивания планшета и хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора
7.3. Приготовление отмывочного раствора.
В случае дробного использования Набора следует отобрать необходимое количество концентрата отмывочного раствора и развести дистиллированной водой в 21 раз (1 мл концентрата отмывочного раствора + 20 мл дистиллированной воды).
7.4. Подготовка различных типов исследуемых образцов
Методики пробоподготовки принципиально различаются для кускового мяса (для которого предполагается только ПОВЕРХНОСТНОЕ загрязнение антигенами свинины) и для обработанных мясопродуктов, которые могут содержать антигены свинины внутри объема.
Для подготовки различных образцов (экстракции) необходимо использовать нейтральный изотонический буферный раствор (например, 0.1М фосфатно-солевой буфер, с добавлением 0.15 М хлорида натрия). При необходимости длительного (более 24 часов) хранения экстрагированного образца в него следует добавить консервант (например, натрия азид до концентрации 0.1%).
Мы рекомендуем пользоваться для экстракции и хранения образцов Консервантом для образцов, кат.№ S075Z (в состав набора не входит), который можно заказать отдельно.
Для обработки некоторых видов образцов необходимы одноразовые принадлежности:
-
тампоны ватные (например, ушные);
-
пластиковые шпатели (например, лопаточки для перемешивания напитков);
-
одноразовые лезвия или скальпели;
-
пробирки пластиковые с винтовой крышкой объемом 15-50 мл (например, Sarstedt кат.№60.732.001)
ВНИМАНИЕ: При всех манипуляциях с образцами необходимо использовать только одноразовые материалы и принадлежности. Взятие проб с индивидуальных больших образцов проводите в одноразовых перчатках, сменяемых ДЛЯ КАЖДОГО ОБРАЗЦА.
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
8.1. Набор реагентов «СВИНИНА-ИФА» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности, указанного на упаковке Набора.
Допускается хранение (транспортировка) Набора при температуре до +25 °С не более 5 суток. Не допускается замораживание целого набора.
8.2. Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 43 исследуемых образцов и 5 калибровочных проб (всего 96 определений).
8.3. В случае дробного использования Набора компоненты следует хранить следующим образом:
- оставшиеся неиспользованными стрипы необходимо тщательно заклеить бумагой для заклеивания планшета и хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора;
- ИФА-Буфер, , конъюгат, субстрат, стоп-реагент после вскрытия флаконов следует хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора;
- калибровочные пробы после вскрытия флаконов следует хранить при температуре +2-8 °С не более 2 месяцев
- оставшийся неиспользованным концентрат отмывочного раствора следует хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора.
- приготовленный отмывочный раствор следует хранить при комнатной температуре (+18-25 °С) не более 5 суток или при температуре +2-8 °С не более 30 суток;
Примечание. После использования реагента немедленно закрывайте крышку флакона. Закрывайте каждый флакон своей крышкой.
8.4. При использовании Набора для проведения нескольких независимых серий анализов следует иметь в виду, что для каждого независимого определения необходимо построение нового калибровочного графика.
8.5. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение Инструкции по применению Набора.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
1
|
Поместите в рамку необходимое количество стрипов - исследуемые образцы в 2 повторах и 10 лунок для калибровочных проб.
|
2
|
Подготовьте образцы пищевых продуктов для анализа, как указано в Таблице М
|
3
|
Внесите во все лунки планшета по 50 мкл ИФА-Буфера.
|
4
|
Внесите в соответствующие лунки в дубликатах по 50 мкл калибровочных проб. В остальные лунки внесите в дубликатах по 50 мкл исследуемых образцов пищевых продуктов.
|
5
|
Аккуратно перемешайте содержимое планшета круговыми движениями по горизонтальной поверхности, заклейте планшет бумагой для заклеивания планшета. Инкубируйте планшет в течение 60 минут при температуре +37°C .
|
6
|
По окончании инкубации удалите содержимое лунок аспирацией (например, с помощью водоструйного насоса) или декантированием и отмойте лунки 3 раза. При каждой отмывке добавьте во все лунки по 250 мкл отмывочного раствора (см. п.7.3), встряхните планшет круговыми движениями по горизонтальной поверхности с последующей аспирацией или декантированием. Задержка при отмывке (замачивание лунок) не требуется. При каждом декантировании необходимо тщательно удалять остатки жидкости из лунок.
|
7
|
По окончании инкубации удалите содержимое лунок и отмойте лунки 3 раза.
|
8
|
Внесите во все лунки по 100 мкл конъюгата.
|
9
|
Заклейте планшет бумагой для заклеивания планшета и инкубируйте его в течение 60 минут при температуре +37°C .
|
10
|
По окончании инкубации удалите содержимое лунок и отмойте лунки 5 раз.
|
11
|
Внесите во все лунки по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2-3 мин. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 10-20 минут в зависимости от степени развития синего окрашивания.
|
12
|
Внесите во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.
|
13
|
Измерьте величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Измерение ОП содержимого лунок планшета необходимо произвести в течение 15 мин после внесения стоп-реагента. Бланк фотометра выставляйте по калибровочной пробе C1.
|
14
|
Постройте в линейных координатах калибровочный график: ось абсцисс (х) - концентрация свиного мяса в калибровочных пробах (Ед/мл), ось ординат (у) - оптическая плотность калибровочных проб (ОП 450 нм). Для алгоритма обсчета (аппроксимации) калибровочного графика используйте интервальный (кусочно-линейный, «от точки к точке») метод.
|
15
|
Определите по калибровочному графику содержание свиного мяса в исследуемых образцах.
|
Таблица М
Вид материала
|
Сбор, хранение и обработка материала
|
Единицы измерения в образце
|
Способ
пересчета значений
|
пищевые продукты
|
Отберите образец пищевого продукта весом 0.5-10 граммов, взвесьте его на аналитических весах и поместите в одноразовую пробирку с плотно закрывающейся (например, винтовой) крышкой. Внимание! Для отбора проб используйте одноразовый инструмент для предотвращения перекрестной контаминации! Твердые мясопродукты измельчите с помощью острого инструмента до получения однородной массы. Если мясопродукт недостаточно влажный, добавьте в полученную массу известный объем воды или любого нейтрального буфера. Тщательно завинтите крышку пробирки и энергично встряхивайте пробирку 15-30 секунд. Поставьте пробирку на стол и дайте осесть образовавшимся частицам. Образовавшаяся над образцом жидкость пригодна для анализа.
Жидкие продукты (бульоны, смывы с кусков мяса, смывы с технологического оборудования) могут быть проанализированы без разбавления, если их pH находится в интервале 6-8. Вязкие бульоны разбавьте 2-10 кратно водой или любым нейтральным буфером. Образец, содержащий взвешенные частицы, осветлите фильтрованием (например, через ткань), или отстаиванием. Полученный образец может быть проанализирован в течение 24 часов. Для более длительного хранения образцов мы рекомендуем одноразовое замораживание или добавление 1/100 объема специального консервирующего раствора (Консервант для образцов, кат№ S075Z).
|
Ед/мл (условного смыва)
|
нет
|
Парное мясо, охлажденное мясо, технологическая поверхность (разделочная доска, нож)
|
Одним тампоном взять мазки с 3-4 участков куска. Если кусок очень большой или подозревается локальное загрязнение, взять таким же образом пробы из разных поверхностных зон куска (до 10-12 точек) и сделать несколько отдельных образцов с одного куска. Тампон(ы) поместить в пробирку с 1 мл экстрагирующего буферного раствора, слегка встряхнуть пробирку и отжать тампон(ы) о внутреннюю стенку пробирки.
|
Ед/мл (условного смыва)
|
нет
|
Замороженное мясо
|
Образец мяса разморозить. Из вытекшего после разморозки мясного сока взять с помощью пипетки 100 мкл образца и перенести в пробирку с 1 мл экстрагирующего буферного раствора. В случае больших кусков и туш рекомендуется брать множественные пробы - как с больших кусков парного мяса.
|
Ед/мл (условного смыва)
|
нет
|
Мясопродукты мягкие (фарш, паштет, котлета, колбаса вареная, консервы)
|
Пробирку для приготовления образца взвесить на лабораторных весах и зафиксировать, как «вес тары». Одноразовым пластиковым шпателем из нескольких участков (зон) продукта отобрать пробы суммарным весом 1.5-2.5 грамма и поместить в пробирку; зафиксировать «вес нетто» образца; добавить к пробам 8 мл экстрагирующего буферного раствора. Тщательно перемешать образец в герметично закрытой пробирке (переворачиванием или встряхиванием на вихревом смесителе). Для тестирования крупных промышленных образцов рекомендуется взять суммарно 15-30 граммов образца из разных участков (зон), поместить в одноразовый стакан и добавить 80 мл экстрагирующего буферного раствора. В этом случае перемешивание образца необходимо вести с помощью одноразового шпателя.
|
Ед/грамм
|
Полученная Концентрация / вес нетто в граммах
|
Колбаса копченая
|
Пробирку для приготовления образца взвесить на лабораторных весах и зафиксировать, как «вес тары». Образец в одноразовой пластиковой чашке Петри измельчить одноразовым лезвием или скальпелем. ВНИМАНИЕ: следите за тем, чтобы в отобранный образец попало как можно больше мясного, а не жирового или соединительнотканного компонента мясопродукта. С помощью одноразового пластикового шпателя перенести часть образца в пробирку, зафиксировать «вес нетто» образца; добавить 8 мл экстрагирующего буферного раствора. Тщательно перемешать образец в герметично закрытой пробирке (переворачиванием или встряхиванием на вихревом смесителе).
|
Ед/грамм
|
Полученная Концентрация / вес нетто в граммах
|
Все описанные выше образцы после подготовки необходимо освободить от взвеси частиц. Для осветления образца можно применить длительное отстаивание (не менее 2 часов), краткое (3-5 минут) центрифугирование при 300-500 g или фильтрование через марлевый тампон или бумажный фильтр. Осветленный образец использовать для анализа немедленно или хранить при +2+8 °С не более 24 часов. При использовании Консерванта для образца (кат.№ S075Z) осветленный образец можно хранить до 7 суток при +2+8 °С. Для более длительного хранения образца рекомендуется замораживание до температуры –20 °С или ниже; в таком случае образец можно хранить более 1 года без изменения его аналитических характеристик.
ВНИМАНИЕ: избегайте повторного размораживания-замораживания образца; такая манипуляция может привести к непредсказуемому снижению количества определяемого антигена. После размораживания образец нужно повторно подвергнуть осветлению (см. выше), так как заморозка-разморозка может вызвать повторное формирование агрегированных частиц.
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ И НОРМЫ
10.1. Основываясь на результатах исследований, проведенных ООО «ХЕМА», рекомендуем пользоваться значениями, приведенными ниже.
|
Единицы
|
Единицы доп.
|
Ед/мл
|
Ед/грамм
|
Верхний предел для смывов
|
Верхний предел для экстрактов
|
Все виды материала
|
20.0
|
10.0
|
По вопросам, касающимся качества Набора
«СВИНИНА-ИФА»,
следует обращаться в ООО «ХЕМА» по адресу:
105043, Москва, а/я 58, тел/факс (495) 737-39-36, 737-00-40, 510-57-07 (многоканальный)
электронная почта: info@xema.ru; rqc@xema.ru
интернет: www.xema.ru; www.xema-medica.com
Руководитель службы клиентского сервиса ООО «ХЕМА»,
к. б. н. Д. С. Кострикин