Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения свиного мяса в пищевых продуктах «свинина-ифа»

СОДЕРЖАНИЕ


CONTENT

_______________________________________________________________________________________________________

Инструкция составлена Руководителем службы клиентского сервиса ООО «ХЕМА», к. б. н. Д. С. Кострикиным

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВИНОГО МЯСА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ «СВИНИНА-ИФА»
 

НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. Набор реагентов «СВИНИНА-ИФА» предназначен для количественного определения концентрации свиного мяса в пищевых продуктах методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Мясо свиньи запрещено к употреблению религиозными конфессиями, а в некоторых странах также законом. Свинина также может являться причиной аллергии. С помощью пары высокоспецифичных антител возможно определение следовых количеств антигенов свиного мяса. Тест определяет с практически одинаковой чувствительностью сырое свиное мясо, полуфабрикаты на его основе, а также мясо, прошедшее любую кулинарную обработку, включая варку, жарку, тушение, копчение.
ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА

Определение свиного мяса основано на использовании «сэндвич»-варианта твердофазного иммуноферментного анализа. На внутренней поверхности лунок планшета иммобилизованы антитела против антигена свиного мяса. Антиген из образца связываются с антителами на поверхности лунки. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью конъюгата антител к другому эпитопу антигена свиного мяса с пероксидазой хрена. В результате образуется связанный с пластиком «сэндвич», содержащий пероксидазу. Во время инкубации с раствором субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) происходит окрашивание растворов в лунках. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации свиного мяса в исследуемом образце. Концентрацию свиного мяса в исследуемых образцах определяют по калибровочному графику зависимости оптической плотности от содержания свиного мяса в калибровочных пробах.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

3.1. Специфичность.

Использование моноклональных антител против антигена скелетной мышцы свиньи (тропомиозинового комплекса) обеспечивает высокую специфичность анализа. Набор не определяет антигенов мяса следующих видов: корова, овца, антилопа, лошадь, лось, олень, курица, индейка, утка, гусь, кролик, грызуны и нечувствителен к следам крови человека. На момент составления данной версии Инструкции нет данных о специфичности данной тест-системы по отношению к мясу верблюда и кенгуру. ВНИМАНИЕ: данный Набор непригоден для определения следов сердечной и гладкой мускулатуры, жировой ткани и кожи (шкурки) свиньи; данные материалы могут давать положительный результат только в случае попадания фрагментов поперечно-полосатой (скелетной) мышечной ткани.

Рыбы Курица Индейка Гусь Утка Страус Лягушка	<0.1%
Корова (говядина) Овца (баранина) Олень Кролик	<0.5%
Мясо лося Лошадь (конина)	<1%

3.2. Воспроизводимость.

Коэффициент вариации результатов определения содержания свиного мяса в одном и том же образце пищевых продуктов с использованием Набора «СВИНИНА-ИФА» не превышает 8,0%.

3.3. Линейность.

Зависимость концентрации антигена свиного мяса в образцах при разведении их ИФА -буфером, имеет линейный характер в диапазоне концентраций 10-300 Ед/мл и составляет ±10%.

3.4. Точность.

Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» – соответствие измеренной концентрации антигена свиного мяса предписанной, полученной путем смешивания равных объемов калибровочных проб 30 и 100 Ед/мл. Процент «открытия» составляет 90-110%.

3.5. Чувствительность.

Минимальная достоверно определяемая Набором «СВИНИНА-ИФА» концентрация свиного мяса в пищевых продуктах не превышает 5 Ед/мл готового экстракта (см. раздел «Подготовка различных типов исследуемых образцов»). По данным предварительного биохимического анализа это составляет около 25 нг/мл «целевого» белка-антигена свиного мяса. Вместе с тем иммунореактивность «целевого» белка значительно вариирует в зависимости от его сохранности в исследуемом материале и от состава самого материала, поэтому результат рекомендуется выдавать не в весовых, а в условных Единицах.

.
СОСТАВ НАБОРА

Код компонента

Символ

Наименование

Количество

Ед.

Описание

1

P366Z

SORB MTP

Планшет 96-луночный полистироловый, стрипированный, готов к использованию

1

шт

-

2

C366Z

CAL 1 - 5

Калибровочные пробы на основе трис-буфера (рН 7.2-7.4), содержащие известные количества свиного мяса - 0; 10; 30; 100; 300 Ед/мл, готовы к использованию (по 0.8 мл каждая)

5

шт

прозрачные жидкости красного цвета (калибровочная проба 0 - прозрачная бесцветная жидкость)

3

T366Z

CONJ HRP

Конъюгат, готов к использованию (11 мл)

1

шт

прозрачная жидкость красного цвета

4

S014Z

DIL

ИФА-Буфер, готов к использованию (11 мл)

1

шт

прозрачная жидкость синего цвета

5

R055Z

SUBS TMB

Раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ), готов к использованию (11 мл)

1

шт

прозрачная бесцветная жидкость

6

S008Z

BUF WASH 21X

Концентрат отмывочного раствора, 21х-кратный (22 мл)

1

шт

прозрачная бесцветная жидкость

7

R050Z

STOP

Стоп-реагент, готов к использованию (11 мл)

1

шт

прозрачная бесцветная жидкость

8

N003

-

Бумага для заклеивания планшета

2

шт

-

9

K366I

-

Инструкция по применению Набора реагентов «СВИНИНА-ИФА»

1

шт

-

10

K366Q

-

Паспорт контроля качества Набора реагентов «СВИНИНА-ИФА»

1

шт

-

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

5.1. Потенциальный риск применения Набора – класс 1

5.2. Все компоненты Набора, за исключением стоп-реагента (5,0% раствор серной кислоты), в используемых концентрациях являются нетоксичными.

Раствор серной кислоты обладает раздражающим действием. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. При попадании на кожу и слизистые пораженный участок следует промыть большим количеством проточной воды.

5.3. При работе с Набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).

5.4. При работе с Набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ

- фотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность содержимого лунок планшета при длине волны 450 нм;

- дозаторы со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы в диапазоне 25-250 мкл;

- цилиндр мерный вместимостью 500 мл;

- бумага фильтровальная
- лабораторные весы с точностью измерения 0,1 грамм (для работы с мясопродуктами)
- острый одноразовый инструмент для измельчения образцов мяса
- Консервант для образцов, кат.№ S075Z (необязательно)
ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

7.1. Перед проведением анализа компоненты Набора и исследуемые образцы следует выдержать при комнатной температуре (+18-25 °С) не менее 30 мин

7.2. Приготовление планшета.

Вскрыть пакет с планшетом и установить на рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся неиспользованными стрипы, чтобы предотвратить воздействие на них влаги, тщательно заклеить бумагой для заклеивания планшета и хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора

7.3. Приготовление отмывочного раствора.

В случае дробного использования Набора следует отобрать необходимое количество концентрата отмывочного раствора и развести дистиллированной водой в 21 раз (1 мл концентрата отмывочного раствора + 20 мл дистиллированной воды).

7.4. Подготовка различных типов исследуемых образцов

Методики пробоподготовки принципиально различаются для кускового мяса (для которого предполагается только ПОВЕРХНОСТНОЕ загрязнение антигенами свинины) и для обработанных мясопродуктов, которые могут содержать антигены свинины внутри объема.

Для подготовки различных образцов (экстракции) необходимо использовать нейтральный изотонический буферный раствор (например, 0.1М фосфатно-солевой буфер, с добавлением 0.15 М хлорида натрия). При необходимости длительного (более 24 часов) хранения экстрагированного образца в него следует добавить консервант (например, натрия азид до концентрации 0.1%).

Мы рекомендуем пользоваться для экстракции и хранения образцов Консервантом для образцов, кат.№ S075Z (в состав набора не входит), который можно заказать отдельно.

Для обработки некоторых видов образцов необходимы одноразовые принадлежности:

• 
  тампоны ватные (например, ушные);
  
• 
  пластиковые шпатели (например, лопаточки для перемешивания напитков);
  
• 
  одноразовые лезвия или скальпели;
  
• 
  пробирки пластиковые с винтовой крышкой объемом 15-50 мл (например, Sarstedt кат.№60.732.001)
  

ВНИМАНИЕ: При всех манипуляциях с образцами необходимо использовать только одноразовые материалы и принадлежности. Взятие проб с индивидуальных больших образцов проводите в одноразовых перчатках, сменяемых ДЛЯ КАЖДОГО ОБРАЗЦА.

УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА

8.1. Набор реагентов «СВИНИНА-ИФА» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности, указанного на упаковке Набора.

Допускается хранение (транспортировка) Набора при температуре до +25 °С не более 5 суток. Не допускается замораживание целого набора.

8.2. Набор рассчитан на проведение анализа в дубликатах 43 исследуемых образцов и 5 калибровочных проб (всего 96 определений).

8.3. В случае дробного использования Набора компоненты следует хранить следующим образом:

- оставшиеся неиспользованными стрипы необходимо тщательно заклеить бумагой для заклеивания планшета и хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора;

- ИФА-Буфер, , конъюгат, субстрат, стоп-реагент после вскрытия флаконов следует хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора;

- калибровочные пробы после вскрытия флаконов следует хранить при температуре +2-8 °С не более 2 месяцев

- оставшийся неиспользованным концентрат отмывочного раствора следует хранить при температуре +2-8 °С в течение всего срока годности Набора.

- приготовленный отмывочный раствор следует хранить при комнатной температуре (+18-25 °С) не более 5 суток или при температуре +2-8 °С не более 30 суток;

Примечание. После использования реагента немедленно закрывайте крышку флакона. Закрывайте каждый флакон своей крышкой.

8.4. При использовании Набора для проведения нескольких независимых серий анализов следует иметь в виду, что для каждого независимого определения необходимо построение нового калибровочного графика.

8.5. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение Инструкции по применению Набора.
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

1	Поместите в рамку необходимое количество стрипов - исследуемые образцы в 2 повторах и 10 лунок для калибровочных проб.
2	Подготовьте образцы пищевых продуктов для анализа, как указано в Таблице М
3	Внесите во все лунки планшета по 50 мкл ИФА-Буфера.
4	Внесите в соответствующие лунки в дубликатах по 50 мкл калибровочных проб. В остальные лунки внесите в дубликатах по 50 мкл исследуемых образцов пищевых продуктов.
5	Аккуратно перемешайте содержимое планшета круговыми движениями по горизонтальной поверхности, заклейте планшет бумагой для заклеивания планшета. Инкубируйте планшет в течение 60 минут при температуре +37°C .
6	По окончании инкубации удалите содержимое лунок аспирацией (например, с помощью водоструйного насоса) или декантированием и отмойте лунки 3 раза. При каждой отмывке добавьте во все лунки по 250 мкл отмывочного раствора (см. п.7.3), встряхните планшет круговыми движениями по горизонтальной поверхности с последующей аспирацией или декантированием. Задержка при отмывке (замачивание лунок) не требуется. При каждом декантировании необходимо тщательно удалять остатки жидкости из лунок.
7	По окончании инкубации удалите содержимое лунок и отмойте лунки 3 раза.
8	Внесите во все лунки по 100 мкл конъюгата.
9	Заклейте планшет бумагой для заклеивания планшета и инкубируйте его в течение 60 минут при температуре +37°C .
10	По окончании инкубации удалите содержимое лунок и отмойте лунки 5 раз.
11	Внесите во все лунки по 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина. Внесение раствора субстрата тетраметилбензидина в лунки необходимо произвести в течение 2-3 мин. Инкубируйте планшет в темноте при комнатной температуре (+18-25°С) в течение 10-20 минут в зависимости от степени развития синего окрашивания.
12	Внесите во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор субстрата тетраметилбензидина, по 100 мкл стоп-реагента, при этом содержимое лунок окрашивается в ярко-желтый цвет.
13	Измерьте величину оптической плотности (ОП) содержимого лунок планшета на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Измерение ОП содержимого лунок планшета необходимо произвести в течение 15 мин после внесения стоп-реагента. Бланк фотометра выставляйте по калибровочной пробе C1.
14	Постройте в линейных координатах калибровочный график: ось абсцисс (х) - концентрация свиного мяса в калибровочных пробах (Ед/мл), ось ординат (у) - оптическая плотность калибровочных проб (ОП 450 нм). Для алгоритма обсчета (аппроксимации) калибровочного графика используйте интервальный (кусочно-линейный, «от точки к точке») метод.
15	Определите по калибровочному графику содержание свиного мяса в исследуемых образцах.

Таблица М

Вид материала	Сбор, хранение и обработка материала	Единицы измерения в образце	Способ пересчета значений
пищевые продукты	Отберите образец пищевого продукта весом 0.5-10 граммов, взвесьте его на аналитических весах и поместите в одноразовую пробирку с плотно закрывающейся (например, винтовой) крышкой. Внимание! Для отбора проб используйте одноразовый инструмент для предотвращения перекрестной контаминации! Твердые мясопродукты измельчите с помощью острого инструмента до получения однородной массы. Если мясопродукт недостаточно влажный, добавьте в полученную массу известный объем воды или любого нейтрального буфера. Тщательно завинтите крышку пробирки и энергично встряхивайте пробирку 15-30 секунд. Поставьте пробирку на стол и дайте осесть образовавшимся частицам. Образовавшаяся над образцом жидкость пригодна для анализа. Жидкие продукты (бульоны, смывы с кусков мяса, смывы с технологического оборудования) могут быть проанализированы без разбавления, если их pH находится в интервале 6-8. Вязкие бульоны разбавьте 2-10 кратно водой или любым нейтральным буфером. Образец, содержащий взвешенные частицы, осветлите фильтрованием (например, через ткань), или отстаиванием. Полученный образец может быть проанализирован в течение 24 часов. Для более длительного хранения образцов мы рекомендуем одноразовое замораживание или добавление 1/100 объема специального консервирующего раствора (Консервант для образцов, кат№ S075Z).	Ед/мл (условного смыва)	нет
Парное мясо, охлажденное мясо, технологическая поверхность (разделочная доска, нож)	Одним тампоном взять мазки с 3-4 участков куска. Если кусок очень большой или подозревается локальное загрязнение, взять таким же образом пробы из разных поверхностных зон куска (до 10-12 точек) и сделать несколько отдельных образцов с одного куска. Тампон(ы) поместить в пробирку с 1 мл экстрагирующего буферного раствора, слегка встряхнуть пробирку и отжать тампон(ы) о внутреннюю стенку пробирки.	Ед/мл (условного смыва)	нет
Замороженное мясо	Образец мяса разморозить. Из вытекшего после разморозки мясного сока взять с помощью пипетки 100 мкл образца и перенести в пробирку с 1 мл экстрагирующего буферного раствора. В случае больших кусков и туш рекомендуется брать множественные пробы - как с больших кусков парного мяса.	Ед/мл (условного смыва)	нет
Мясопродукты мягкие (фарш, паштет, котлета, колбаса вареная, консервы)	Пробирку для приготовления образца взвесить на лабораторных весах и зафиксировать, как «вес тары». Одноразовым пластиковым шпателем из нескольких участков (зон) продукта отобрать пробы суммарным весом 1.5-2.5 грамма и поместить в пробирку; зафиксировать «вес нетто» образца; добавить к пробам 8 мл экстрагирующего буферного раствора. Тщательно перемешать образец в герметично закрытой пробирке (переворачиванием или встряхиванием на вихревом смесителе). Для тестирования крупных промышленных образцов рекомендуется взять суммарно 15-30 граммов образца из разных участков (зон), поместить в одноразовый стакан и добавить 80 мл экстрагирующего буферного раствора. В этом случае перемешивание образца необходимо вести с помощью одноразового шпателя.	Ед/грамм	Полученная Концентрация / вес нетто в граммах
Колбаса копченая	Пробирку для приготовления образца взвесить на лабораторных весах и зафиксировать, как «вес тары». Образец в одноразовой пластиковой чашке Петри измельчить одноразовым лезвием или скальпелем. ВНИМАНИЕ: следите за тем, чтобы в отобранный образец попало как можно больше мясного, а не жирового или соединительнотканного компонента мясопродукта. С помощью одноразового пластикового шпателя перенести часть образца в пробирку, зафиксировать «вес нетто» образца; добавить 8 мл экстрагирующего буферного раствора. Тщательно перемешать образец в герметично закрытой пробирке (переворачиванием или встряхиванием на вихревом смесителе).	Ед/грамм	Полученная Концентрация / вес нетто в граммах

Все описанные выше образцы после подготовки необходимо освободить от взвеси частиц. Для осветления образца можно применить длительное отстаивание (не менее 2 часов), краткое (3-5 минут) центрифугирование при 300-500 g или фильтрование через марлевый тампон или бумажный фильтр. Осветленный образец использовать для анализа немедленно или хранить при +2+8 °С не более 24 часов. При использовании Консерванта для образца (кат.№ S075Z) осветленный образец можно хранить до 7 суток при +2+8 °С. Для более длительного хранения образца рекомендуется замораживание до температуры –20 °С или ниже; в таком случае образец можно хранить более 1 года без изменения его аналитических характеристик.

ВНИМАНИЕ: избегайте повторного размораживания-замораживания образца; такая манипуляция может привести к непредсказуемому снижению количества определяемого антигена. После размораживания образец нужно повторно подвергнуть осветлению (см. выше), так как заморозка-разморозка может вызвать повторное формирование агрегированных частиц.


ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ И НОРМЫ

10.1. Основываясь на результатах исследований, проведенных ООО «ХЕМА», рекомендуем пользоваться значениями, приведенными ниже.

	Единицы	Единицы доп.
	Ед/мл	Ед/грамм
	Верхний предел для смывов	Верхний предел для экстрактов
Все виды материала	20.0	10.0

По вопросам, касающимся качества Набора «СВИНИНА-ИФА»,

следует обращаться в ООО «ХЕМА» по адресу:

105043, Москва, а/я 58, тел/факс (495) 737-39-36, 737-00-40, 510-57-07 (многоканальный)
электронная почта: info@xema.ru; rqc@xema.ru
интернет: www.xema.ru; www.xema-medica.com
Руководитель службы клиентского сервиса ООО «ХЕМА»,

к. б. н. Д. С. Кострикин