Название темы нир




Скачать 277.91 Kb.
НазваниеНазвание темы нир
страница1/3
Дата публикации07.06.2014
Размер277.91 Kb.
ТипОтчет
literature-edu.ru > Лекции > Отчет
  1   2   3
Отчет лаборатории эпигенетики о результатах НИР за 2009 год
Название темы НИР: «Генетическая изменчивость отдельных хромосомных локусов и ее значение в клиническом полиморфизме при онкологических заболеваниях и менделирующих формах аномалий развития».

Руководитель: Залетаев Д.В.

Исполнители: Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Землякова В.В., Кузнецова Е.Б., Михайленко Д.С., Иванов М.А., Кекеева Т.В., Шкарупо В.В., Танас А.С.

Годы выполнения: 2008 г. – 2010 гг.


  1. Основные результаты научных исследований по теме НИР за 2009 год

Поиск и характеристика мутаций гена VHL при спорадическом раке почки.

Инактивация гена VHL вследствие молекулярно-генетических нарушений выявляется в большинстве светлоклеточных карцином почки, при этом влияние инактивирующих событий на развитие опухоли неоднозначно. Были изучены мутации, аллельные делеции и метилирование как причины инактивации гена VHL в выборке 123 СРП. С целью поиска мутаций в кодирующей части VHL амплифицировали 3 экзона и проводили SSCP-анализ с последующим секвенированием. Мутации VHL были определены в 31.7% (39/123) СРП. Все выявленные мутации соматические. Среди мутаций 69.2% (27/39) составляли делеции, протяженность которых варьировала от 1 до 42 п.н., 18.0% (6/39) – инсерции, дупликации и комплексная мутация, оставшиеся 12.8% (5/39) приходятся на однонуклеотидные замены. Впервые идентифицированные мутации определены в 84.6% (33/39) образцов СРП. Большинство делеций и инсерций, а также дупликации и комплексная мутация, составляющие 56.4% (22/39) мутаций, приводили к сдвигу рамки считывания и формированию новых стоп-кодонов. Три делеции в первом экзоне и одна в 3’-области второго экзона не меняли рамку считывания, но сопровождались потерей сайтов связывания HIF1-α и элонгина С, соответственно. Делеция c.340+2_340+4del повреждала донорный сайт сплайсинга в первом интроне, а делеция c.464-1_469del – акцепторный сайт сплайсинга во втором интроне.

Анализ влияния мутаций на структуру транскрипта проводился с помощью интерактивной программы поиска сайтов сплайсинга (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). Делеция c.336_340del формировала стоп-кодон вместо остатка тирозина в позиции 112. Соматические мутации в виде однонуклеотидных замен представляли собой миссенс мутации p.Asn78Lys (2 случая), p.Tyr98Phe, p.Leu158Val и нонсенс-мутацию p.Glu51X. Первые три миссенс-мутации изменяли структуру участка связывания HIF1-α в β-домене белка VHL, тогда как p.Leu158Val затрагивала участок связывания элонгина С в α-домене VHL. Оба домена необходимы для выполнения белком VHL своей функции.

При спорадическом РП тип мутации VHL может иметь значение для клинической практики, например, при назначении антиангиогенных препаратов.

Поиск и характеристика аллельных делеций при спорадическом раке почки.

Аллельные делеции гена VHL при СРП определяли по STR-маркерам D3S1317 и D3S1038. Проанализированы 94 образца замороженных тканей опухолей и соответствующих им образцов нормальной почечной паренхимы, взятых на расстоянии не менее 1.5 см от края новообразования. Информативность используемых микросателлитных локусов составила 47.9% (45/94) для D3S1317 и 77.7% (73/94) – для D3S1038. Система из двух STR-маркеров позволяла определять аллельные делеции в 91.5% (86/94) случаев. ПГ обнаружена в 27.9% (24/86) парных информативных образцов СРП. Инактивация VHL может быть обусловлена биаллельными делециями и ПГ в неинформативных случаях, доля которых составила 8.5% (8/94) образцов.

Помимо VHL, для СРП характерны аллельные делеции других генов-супрессоров, локализованных в области 3р, которые могут оказывать влияние на развитие злокачественного новообразования. Для определения прогностической значимости аллельных делеций генов-супрессоров в настоящем исследовании определена ПГ областей локализации генов VHL, RASSF1, FHIT (гены-супрессоры в области 3p) и ТР53. Использовались STR-маркеры D3S1568 и D3S966 (RASSF1), D3S1300 и D3S1234 (FHIT), D17S1353 и IVS1 (TP53). Информативность STR-локуса D3S1568 составила 58.5% (55/94), D3S966 – 62.8% (59/94), D3S1300 – 67.0% (63/94), D3S1234 – 85.1% (80/94), D17S1353 – 67.0% (63/94) и IVS1 – 61.7% (58/94).

Системы из двух вариабельных локусов позволяли определять ПГ гена RASSF1 в 85.1% (80/94), FHIT – 95.7% (90/94) и TP53 – 89.4% (84/94) случаев. ПГ гена RASSF1 обнаружена в 27.5% (22/80), FHIT – 35.6% (32/90), TP53 – 17.9% (15/84) и, как упоминалось ранее, VHL – 27.9% (24/86) информативных образцов СРП. Аллельные делеции хотя бы одного гена на 3р наблюдали в 56.4% (53/94), а в совокупности из четырех исследованных генов – в 60.6% (57/94) информативных случаев.

Характеристика аномального метилирования генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 при спорадическом раке почки.

Изучено метилирование 5’-регуляторных областей генов-супрессоров, локализованных в области 3р (VHL, RASSF1 и FHIT), а также генов SFRP1 и CDH1. Метилирование определено МЧ-ПЦР с предварительным гидролизом геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой BstHHI. Исследованы 98 парных образцов светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином, 29 парафиновых блоков СРП. В образцах гистологически не измененной почечной парнехимы гиперметилирование генов-супрессоров не выявлено, что позволило рассматривать метилирование в образцах опухолевой ткани как аберрантное. В опухолях аберрантное метилирование VHL определено в 14.2% (18/127), RASSF1 – 52.8% (67/127), FHIT – 54.3% (69/127), SFRP1 – 33.1% (42/127) и CDH1 – 41.7% (53/127) случаев. Результаты, полученные методом МЧ-ПЦР, подтверждены бисульфитным секвенированием анализируемых участков генов. Как уже было отмечено, аберрантное метилирование VHL специфично для СРП и его частота близка к данным литературы. Аберрантное метилирование других генов-супрессоров, локализованных на 3р, встречается с большей частотой и обнаружено в образцах опухолей различных гистологических типов. RASSF1 метилирован в 53.7% (66/123) светлоклеточных и в 1 из 2 папиллярных карцином, FHIT – в 54.5% (67/123) светлоклеточных, в 1 из 2 папиллярных и в 1 из 2 хромофобных карцином. Частота аберрантного метилирования исследованных генов варьировала от 14.2 до 54.3%. Метилирование как минимум одного из исследованных генов обнаружено в 85.0% (108/127) образцов. Помимо обнаруженных ассоциаций метилирования CDH1 и RASSF1 с клинико-патологическими характеристиками заболевания, анализируемые гены можно рассматривать как элементы диагностической системы маркеров метилирования при РП.

Метилирование гена HOXB13 при спорадическом раке почки.

Перспективным маркером может оказаться ген HOXB13, промотор которого был аберрантно метилирован в 5 из 17 образцов первичного СРП. Проведено бисульфитное секвенирование промотора гена HOXB13 в 5 образцах СРП и соответствующих им образцах гистологически не измененной ткани. Показано, что в опухолях подвергаются аберрантному гиперметилированию цитозины в составе CpG-динуклеотидов, преимущественно, в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG. Можно предположить, что анализ четырех CpG-динуклеотидов, аберрантное метилирование которых показано в настоящей работе, позволит достоверно оценивать метилирование промотора HOXB13 в опухолях почки. Интересно, что CpG-островок HOXB13 локализован в 30 п.н. от микросателлитного локуса (GA)n, что позволяет анализировать аллельное метилирование этого гена методами МЧ-ПЦР или МС-ПЦР.

Поиск клинических корреляций с молекулярными нарушениями при раке почки.

С целью выяснения роли различных типов инактивирующих событий VHL на развитие первичной опухоли и прогноз заболевания пациенты были классифицированы на парные клинические группы. Группы были сформированы по следующим признакам: начальные (I и II) и поздние (III и IV) стадии заболевания, по степени дифференцировки первичной опухоли – группы GI-II и GIII-IV, локализованные (Т1-2) и местно распространенные (Т3-4) опухоли (в других частях работы), наличие (любое положительное N /или М) и отсутствие (TxN0M0) метастазов на момент постановки диагноза. Объединение в парные группы обусловлено малым (<30) количеством пациентов в некоторых индивидуальных подгруппах, а также особенностями диагностики и лечения РП на ранних и поздних стадиях. В парных клинических группах сравнивали встречаемость мутаций, ПГ и метилирования. Выявлена ассоциация ПГ области локализации VHL с наличием метастазов на момент постановки диагноза: Р = 0.004, OR = 5.60 (95% CI: 1.72-18.23). Кроме того, исследуемые группы разделили на выборки пациентов с хотя бы одним выявленным нарушением VHL и без инактивирующих событий этого гена. Сравнительный анализ показал ассоциацию инактивирующих событий в гене VHL с метастазированием первичной опухоли: Р = 0.033, OR = 3.04 (95% CI: 1.09-8.48). Не обнаружено ассоциации соматических мутаций и метилирования VHL с метастазированием, степенью дифференцировки и местным распространением первичной опухоли, а также со стадией заболевания.

У больных СРП первой стадии соматические мутации в гене VHL выявлены в 35.4% (23/65) случаев, ПГ – в 28.2% (11/39) информативных случаев и аберрантное метилирование – в 20.0% (13/65) образцов. В целом, хотя бы одно из нарушений гена VHL обнаружено у 53.8% (35/65) больных с первой стадией заболевания, что свидетельствует в пользу инактивации VHL на ранних стадиях СРП.

Проведен сравнительный анализ встречаемости ПГ в парных клинических группах. Исследовали ПГ по отдельным генам, по области 3р, и по всем локусам одновременно. Выявлена ассоциация аллельных делеций по двум и более генам-супрессорам, локализованным на коротком плече хромосомы 3, с наличием метастазов на момент постановки диагноза: Р = 0.036, OR = 1.49 (95% CI: 1.01-2.33). При сравнении пациентов с аллельными делециями двух и более генов из всех исследованных подобной ассоциации не наблюдается: Р = 0.144 (10/54 vs 13/39) для стадий заболевания, Р = 0.135 (12/61 vs 11/32) – степени дифференцировки первичной опухоли, Р = 0.220 (11/56 vs 12/37) – размера первичной опухоли по TNM-классификации и Р = 0.118 (16/76 vs 7/17) – наличия метастазов на момент постановки диагноза. Можно предположить, что ПГ нескольких генов-супрессоров на 3р связана с опухолевой прогрессией, в отличие от аллельных делеций одного из исследованных генов в области 3р или гена ТР53.

Проведен сравнительный анализ частот метилирования в парных клинических группах. Показана ассоциация метилирования CDH1 с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024, OR = 2.40 95% CI: 1.13-5.08) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001, OR = 5.98 95% CI: 2.03-17.59). Инактивацию гена CDH1 вследствие метилирования можно рассматривать как событие, способствующее инвазивному росту и метастазированию первичной опухоли. Анализ аберрантного метилирования CDH1 на сегодняшний день представляется одним из перспективных прогностических маркеров РП.

Показано, что метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047, OR = 2.58, 95%CI: 1.04-6.35). Можно предположить, что метилирование VHL, RASSF1 и FHIT встречается в значительной доле случаев РП уже на первой стадии, тогда как с прогрессией первичной опухоли ассоциировано аберрантное метилирование RASSF1, которое может считаться потенциальным неблагоприятным маркером на ранних стадиях РП. Были проанализированы случаи сочетанного метилирования рассматриваемых генов-супрессоров в различных клинических группах пациентов. Не выявлено ассоциаций сочетанного метилирования с клинико-патологическими характеристиками заболевания.

Системы маркеров для ранней диагностики, прогноза течения заболевания и повышения эффективности таргетной терапии рака почки.

Инактивация VHL влияет не только на развитие первичной опухоли, но и может определять тактику лечения СРП. Опухоли почки не чувствительны к лучевой терапии и химиотерапии, и основным методом лечения как локализованного, так и распространенного РП остается хирургический. Стандартное лечение СРП при наличии множественных отдаленных метастазов заключалось в иммунотерапии высокими дозами интерлейкина-2 и интерферона α, однако иммунотерапия эффективна лишь у 20% больных метастатическим СРП. Таргетные препараты представляют собой ингибиторы определенных тирозинкиназ или факторов роста и, в отличие от традиционных цитостатиков, взаимодействуют лишь с определенными молекулами, играющими ключевую роль в развитии РП. Наиболее универсальным в классе таргетных препаратов является сорафениб («Нексавар»), который обладает активностью мультикиназного ингибитора, подавляющего как клеточную пролиферацию, так и ангиогенез. Препарат ингибирует тирозинкиназы VEGFR, PDGFR, KIT, RET, а также серинтреонинкиназы BRAF, CRAF. По результатам клинических испытаний в соответствии с протоколом TARGET, суммарный объективный ответ на сорафениб составил 84% (полные и частичные регрессии, а также стабилизация процесса). Ключевые мишени Нексавара (VEGFR 1-го и 2-го типов, PDGFR) гиперэкспрессируются в ответ на инактивацию гена VHL. Следовательно, СРП, несущий молекулярно-генетические нарушения VHL, может представлять собой наиболее оптимальный случай для терапии этим препаратом. Таким образом, соматические мутации, ПГ и аберрантное метилирование промотора VHL могут рассматриваться как перспективные маркеры СРП. Указанные молекулярно-генетические нарушения VHL присутствуют в первичной опухоли на ранних стадиях заболевания, влияют на прогрессию опухоли и ее чувствительность к таргетным препаратам.

Так же нами показано, что множественные аллельные делеции генов на 3р, вовлекающие два и более из перечисленных выше генов-супрессоров, и метилирование промотора CDH1 ассоциированы с прогрессией первичной опухоли и ее способностью к метастазированию. Таким образом, исследование ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT, и метилирования гена CDH1 может быть использовано вместе с другими необходимыми тестами при назначении адьювантной иммунотерапии после удаления первичной опухоли при местнораспространенном СРП.

Резюме.

Соматические мутации, потеря гетерозиготности и метилирование гена VHL выявлены у 54% пациентов на первой стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании. Впервые идентифицированы 33 новые мутации VHL.

Аллельные делеции двух и более генов-супрессоров (VHL, RASSF1, FHIT), локализованных на коротком плече хромосомы 3, ассоциированы с наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.036), что может отражать прогрессию первичной опухоли.

Аберрантное метилирование 5’-регуляторных областей гена VHL составляет 14%, RASSF1 – 53%, FHIT – 54%, SFRP1 – 33% и CDH1 – 42% случаев РП. Метилирование хотя бы одного из исследованных генов происходит в 85% случаев РП. Метилирование CDH1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001). Метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047). Метилирование RASSF1 и CDH1 может рассматриваться в качестве неблагоприятного прогностического маркера на различных стадиях РП.

Построена карта метилирования CpG-островка гена HOXB13 при СРП. Аберрантному метилированию, преимущественно, подвергаются цитозины в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG, что может быть использовано при определении частоты метилирования HOXB13 в опухолях почки.

Название темы НИР: «Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в процессах канцерогенеза».

Руководитель: Залетаев Д.В.

Исполнители: Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Землякова В.В., Кузнецова Е.Б., Михайленко Д.С., Сухорукова М.В., Иванов М.А., Кекеева Т.В., Шкарупо В.В., Танас А.С.

Годы выполнения: 2008 г. – 2010 гг.


  1. Основные результаты научных исследований по теме НИР за 2009 год


Идентификация и характеристика новых генов, вовлеченных в канцерогенез, на основе скрининга дифференциального метилирования геномов.

Скрининг дифференциального метилирования проводился методом амплификации интерметилированных сайтов (АИМС). Использована разработанная в лаборатории технология АИМС для одновременного определения метилирования 30 классических CpG-островков в одной реакции. Состояние метилирования промоторных CpG-островков генов ATP2B4, MAFK, STOX2, DFNB31, FZD10, AK123838, C14orf4, POMT2, GSTZ1, AX746725, AK127124, JUB, ANK3, ATMIN, PURB, ABCG4, PPP2R5C, NFYB, PARP6, TMEM176A, TMEM176B, FOXM1, C12orf32, C2CD2, IQSEC2, KIAA1324L, CUX1, ZBTB4, ITGA9, EST CN371412 и участка межгенного CpG-островка, локализованного в сегменте хромосомы 13q32.1 оценивалось в образцах рака молочной железы (РМЖ), прилежащей условно нормальной ткани молочной железы, в нормальных лимфоцитах периферической крови и в клеточной линии острого лейкоза Jurkat. В образцах рака молочной железы аномальное метилирование выявлено для CpG-островков 12 генов (ATP2B4, AK123838, AX746725, AK127124, TMEM176A, TMEM176B, FOXM1, C12orf32, KIAA1324L, C2CD2, ITGA9 и EST CN371412) и участка межгенного CpG-островка, локализованного в сегменте хромосомы 13q32.1 – в общей сложности, для 9 CpG-островков. Клетки Jurkat продемонстрировали положительное метилирование CpG-островков генов ANK3, C2CD2, AK123838, AX746725, AK127124, TMEM176A, TMEM176B и EST CN371412. В ДНК из лимфоцитов периферической крови метилирования CpG-островков генов ANK3, C2CD2, ATP2B4, AK123838, AX746725, AK127124, TMEM176A, TMEM176B, FOXM1, C12orf32, KIAA1324L, ITGA9, EST CN371412 и межгенного CpG-островка 13q32.1 не обнаружено. Аномальное метилирование указанных CpG-островков, ассоциированное с РМЖ и острым лимфобластным лейкозом показано впервые.

Показатели метилирования генов, идентифицированных методом АИМС, в клетках различной природы.


Ген (локус)

Частота метилирования при РМЖ, %

Частота метилирования в условно нормальных образцах молочной железы, %

Наличие метилирования в клетках Jurkat

ANK3

0

0

+

ATP2B4

42

25

-

EST CN371412

3

0

+

C2CD2

3

0

+

AX746725

AK127124

6

0

+

TMEM176A

TMEM176B

4

0

+

FOXM1

C12orf32

12

0

-

KIAA1324L

10

0

-

ITGA9

7

0

-

Межгенный CpG-островок (13q32.1)

2

0

-

  1   2   3

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Название темы нир iconПроекта
Название проекта должно отражать суть нир, которую заявители считают необходимым выполнить и обозначать действие (разработка, исследование,...

Название темы нир iconПрограмма научно-исследовательской работы основная образовательная...
Нир является обязательной составляющей образовательной программы профессиональной подготовки магистра. Нир направлена на подготовку...

Название темы нир iconНазвание темы, разделов
Объяснит-иллюстр., проблемно-поисковый, беседа, работа с книгой, демонстрация, иллюстрации,икт

Название темы нир iconНазвание раздела или темы
Знакомство с учебником по литературному чтению. Система условных обозначений. Содержание учебника. Словарь

Название темы нир iconНазвание темы, разделов
Уметь: определять принадлежность отдельных произведений к литературным направлениям 19 века; владеть монологической и диалогической...

Название темы нир iconДетско-юношеская спортивная школа «лидер»
Указать изученные темы, название методической литературы и статей, посещённые семинары, курсы, конференции

Название темы нир iconТематическое планирование № Название темы Кол-во часов Дата проведения
Жанр былины в русском фольклоре, происхождение былин. Киевская былина. Образ Ильи в русских былинах

Название темы нир iconТематическое планирование уроков литературного чтения №
...

Название темы нир iconНаучно-исследовательская работа Научно-исследовательская работа Научно-исследовательская...
Научно-исследовательская работа (нир) относится к циклу М. 3 дисциплин ооп впо (магистратуры) «Политическое консультирование» по...

Название темы нир iconПрограмма (название, автор) Кол-во часов Класс Авторы и название...

Литература


При копировании материала укажите ссылку © 2015
контакты
literature-edu.ru
Поиск на сайте

Главная страница  Литература  Доклады  Рефераты  Курсовая работа  Лекции