Оглавление
Оглавление 1
Особенности метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез. 1
Краткая характеристика рака молочной железы
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований среди женщин.
Для большинства новообразований молочной железы источником клеток служат терминальные дольково-протоковые элементы, которые включают железистые компоненты нормальной паренхимы.
К факторам риска развития РМЖ относятся наличие больных РМЖ в семье; увеличение репродуктивного периода жизни (раннее начало менструации и поздняя менопауза); поздние первые роды; ожирение, сопровождающееся синтезом эстрогенов в жировых депо; лечение эстрогенами и длительное использование оральных контрацептивов; наличие фиброзно-кистозных изменений в молочной железе с атипичной гиперплазией эпителия; воздействие канцерогенных факторов (радиация, химические канцерогены и т.п.).
Выделяют наследственные и спорадические формы РМЖ. На сегодняшний день известно, что наследственные формы РМЖ напрямую зависят от мутаций в генах, отвечающих за репарацию ДНК (BRCA1, BRCA2).
Спорадический рак возникает при накоплении целого ряда соматических мутаций в различных генах. Комплекс молекулярно-генетических изменений, которые характерны для спорадического РМЖ, включает в себя активацию некоторых семейств протоонкогенов, структурную и функциональную инактивацию генов-супрессоров, характерные делеции некоторых хромосомных районов, ассоциированных с РМЖ.
Особенности метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез.
Метилирование цитозина в 5’-положении пиримидинового кольца – доминирующая эпигенетическая модификация ДНК в геноме человека. Термин «эпигенетическая» подразумевает, что метилирование изменяет информацию, содержащуюся в ДНК, не меняя первичной нуклеотидной последовательности. Не нарушая структуры генов и функций кодируемых ими продуктов, метилирование ДНК предоставляет информацию о том, где, когда и какие гены должны экспрессироваться.
Эпигенетические нарушения, наряду со структурными повреждениями генетического аппарата, играют важнейшую роль в формировании фенотипов опухолевых клеток. Свойство паттернов метилирования ДНК сохраняться (наследоваться) в ряду клеточных делений с высокой точностью (частота ошибок для индивидуального CpG-динуклеотида 0.1-4х10-2 на один цикл репликации) потенцирует формирование опухолеспецифических метилотипов, с одной стороны, и создаёт предпосылки для разработки надёжных средств молекулярной диагностики рака, с другой.
До недавнего времени считалось, что CpG-островки обычно располагаются в промоторных областях генов «домашнего хозяйства» и в норме неметилированы. Метилирование этих участков при патологии приводит к репрессии транскрипции генов и проявлению соответствующих фенотипов, в том числе ассоциированных с канцерогенезом. Однако результаты секвенирования генома человека показали, что CpG-островки могут располагаться на всем протяжении генов, включая экзоны, интроны и 3’-нетранслируемые области, причем некоторые из них могут демонстрировать метилирование и в норме. Кроме того, эпигенетические характеристики CpG-островков зависят от пространственного распределения содержащихся в них метилированных CpG-динуклеотидов. Различают коровое, некоровое и диссеминированное метилирование. Первый вариант подразумевает плотное метилирование участков CpG-островков, расположенных в функционально наиболее значимых регуляторных областях генов, приводящее к снижению их транскрипции.
Аномальное метилирование CpG-островков генов-супрессоров опухолевого роста, приводящее к их инактивации, является одним из наиболее значимых механизмов канцерогенеза, и может выступать как одно из событий в двухударной модели Кнадсена. В этом случае метилирование выступает как функциональная мутация (делеция). Некоровое метилирование также затрагивает непрерывную последовательность CpG-динуклеотидов, однако, в силу своей локализации не блокирует экспрессии генов. Тем не менее, некоровое метилирование часто наблюдается при раке. Старение и хроническое воспаление также сопровождаются повышенным уровнем метилирования именно некоровых областей CpG-островков. Некоровое и диссеминированное (рассеянное) метилирование рассматривается как предвестники метилирования коровых областей, и, соответственно, могут быть использованы как маркер риска развития злокачественных новообразований. Кроме того, непромоторные CpG-островки в большей степени предрасположены к метилированию при раке, что может служить ценным диагностическим и прогностическим показателем. Поскольку любые изменения метилирования, ассоциированные с онкологическим процессом, представляют диагностическую ценность, независимо от их влияния на экспрессию генов, при разработке новых эпигенетических онкомаркеров должны рассматриваться все варианты метилирования CpG-островков генов, вовлеченных в канцерогенез [1,5].
Значение нарушений метилирования ДНК при РМЖ как молекулярных маркеров канцерогенеза.
В практической онкогеномике предполагается три области использования маркеров аномального метилирования ДНК. Во-первых, выявление паттернов метилирования, достоверно ассоциированных с малигнизацией, в образцах биопсийного материала, протокового аспирата или в свободной ДНК из плазмы крови может использоваться для выявления опухолевого процесса как такового. Во-вторых, аномальное метилирование ряда CpG-островков может служить маркёром того или иного фенотипа опухоли, прогноза течения заболевания, ответа на терапию и/или побочных эффектов лечения. В-третьих, аномальное метилирование некоторых локусов в морфологически неизмененных клетках ассоциировано с повышенным риском малигнизации и может служить предиктивным маркером рака [6].
Аномальное метилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, при РМЖ.
NB. RASSF1A ATM [3, 5]
На сегодняшний день известен целый ряд генов, метилирование CpG-островков которых ассоциировано с развитием РМЖ. Это гены – регуляторы клеточного цикла (CDKN2A, CDKN2B, p14/ARF, RB1, циклины D1 и D2, и др.), гены, ответственные за апоптоз (TP53, CDKN1A, HOX5, MDM2, DAPK1, TWIST1, TMS1, FHIT), гены, отвечающие за инвазию и метастазирование опухолевых клеток (CDH1, CDH13, CTNB), гены гормон– и рецептор-опосредованного сигналинга (ESR1, PR, RARβ), а также гены систем репарации ДНК (BRCA1) и детоксикации ксенобиотиков (GSTP1). Ниже описаны характеристики эпигенетической патологии при РМЖ для наиболее изученных из перечисленных генов.
Гены – регуляторы клеточного цикла.
В этой группе генов наиболее изученным с точки зрения эпигенетических нарушений при опухолевом процессе является ген CDKN2A. Ген кодирует ингибитор циклин-зависимых киназ, регулирующий прохождение клетки через G1-фазу путём связывания с киназами CDK4 и CDK6, ингибирующими фосфорилирование белка RB. CDKN2A является одним из наиболее часто инактивируемых при РМЖ генов – супрессоров опухолевого роста, причём основным механизмов его инактивации считается аномальное метилирование промоторного CpG-островка, детектируемое в 15-30% случаев РМЖ.
Результаты исследований ассоциаций изменения экспрессии CDKN2A с прогнозом заболевания противоречивы: по данным одних авторов, неблагоприятный прогноз ассоциирован с увеличением экспрессии, по данным других – с уменьшением.
Исследования аномального метилирования 5’-области гена также приводили к неоднозначным результатам. Расхождения объясняются различиями в дизайне экспериментов и, главным образом, в выборе области промоторного CpG-островка гена, подвергающейся анализу в каждом конкретном случае. Поскольку метилирование распределено на протяжении CpG-островков неравномерно и модификация различных CpG-пар по-разному влияет на экспрессию генов, правильный выбор системы праймеров для определения метилирования может основываться только на достоверной информации о структурно–функциональной организации изучаемой C,G-богатой области.
Структурно-фунциональная организация промоторной области гена CDKN2A до сих пор изучена лишь на материале одной клеточной линии человека (Т24, рак мочевого пузыря) и клеточной линии нормальной молочной железы и фибробластов крысы. В первом исследовании было показано, что только метилирование небольшой (230 п.н.) области промоторного CpG-островка CDKN2A приводит к подавлению экспрессии гена. Метилирование же других участков этого CpG-островка, который имеет протяжённость свыше 1 т.п.н. и захватывает весь первый экзон и участок первого интрона гена, не влияет на эффективность транскрипции в клетках Т24. В то же время, именно метилирование первого экзона CDKN2A наблюдается при РМЖ значительно чаще (~50%), чем метилирование промотора и, вероятно, может служить более информативным диагностическим маркером.
Причиной противоречивости данных об ассоциации метилирования CpG-островка гена CDKN2A с его экспрессией, возможно, является множественность транскриптов гена. Известно, что последовательность CDKN2A служит матрицей для нескольких альтернативных транскриптов, различающихся по своим первым экзонам. По крайней мере две из них кодируют структурно гомологичные CDKN2A белки, также функционирующие как ингибиторы циклин-зависимых киназ, однако, исследований корреляций между метилированием CpG-островка CDKN2A и экспрессией каждой из его изоформ не проводилось.
Своеобразным транскриптом CDKN2A является p14/ARF (Alternative Reading Frame), отличающийся от остальных не только альтернативным первым экзоном, расположенным на 20 т.п.н. проксимальнее консенсусной последовательности CDKN2A и ассоциированным с собственным CpG-островком, но и альтернативной рамкой считывания, обеспечивающей синтез белка, структурно и функционально негомологичного другим вариантам CDKN2A. Ядерный белок p14 (ARF) обладает способностью стабилизировать и активизировать белок р53 – «хранитель генома» - за счет инактивации MDM2, вызывающего деградацию р53. В то же время, повышение количества активного р53 в клетке подавляет экспрессию p14/ARF и активизирует транскрипцию MDM2. Таким образом, в клетке существует авторегуляторная «петля», которая связывает экспрессию ряда генов (ТР53, p14/ARF и MDM2). Метилирование промотора p14/ARF нарушает нормальный механизм поддержания уровня р53 в клетке. При РМЖ метилирование CpG-островка p14/ARF наблюдается в 50% образцов, для которых показано снижение экспрессии гена методом ПЦР обратных транскриптов (ОТ-ПЦР), причём ряд исследователей отмечает конкордантность метилирования промоторных CpG-островков генов p14/ARF и CDKN2A.
Белок RB1, ключевой участник регуляторной цепи CDKN2A/RB1, является негативным регулятором клеточного цикла. В нормальных клетках RВ1 экспрессируется на протяжении всего клеточного цикла, его продукт подавляет активность различных генов, чья экспрессия необходима для роста и пролиферации клетки. В то же время, этот белок увеличивает активность некоторых факторов транскрипции (например, C/EBP), которые участвуют в конечных этапах клеточной дифференцировки. Аномальное метилирование и/или подавление экспрессии гена RB1 наблюдается в 10-20% первичных опухолей РМЖ. Показана ассоциация повреждений RB1 с опухолями, не имеющими метастазов в лимфоузлах, при этом не обнаружено корреляции этих повреждений с отсутствием рецидивов или увеличением выживаемости.
Ген-супрессор RIZ1 кодирует белок, взаимодействующий с RВ1 и относящийся к суперсемейству гистоновых метилтрансфераз. Снижение уровня мРНК RIZ1 в опухолях ассоциировано с метилированием CpG-островка, локализованного в промоторе гена. Метилирование промотора RIZ1 определено в 44% образцов РМЖ и четко коррелирует со снижением или исчезновением экспрессии. Обработка ингибитором метилирования 5-аза-2’-деоксицитидином приводит к активации экспрессии гена в опухолевых клетках.
Циклины типа D (циклины D1, D2 и D3) вовлечены в регуляцию перехода клетки из G1 в S-фазу. Характерным отличием циклина D2, кодируемого геном CCND2, от других представителей семейства является значительное повышение экспрессии в условиях ареста клеточного роста в культуре фенотипически нормальных фибробластов. Эктопическая гиперэкспрессия циклина D2 эффективно блокирует прогрессию клеточного цикла. Гиперметилирование CpG-островка промоторной области CCND2, ассоциированное с подавлением экспрессии гена выявлено приблизительно в половине образцов РМЖ. Гиперметилирование промотора было выявлено в случаях протоковой карциномы in situ, прозволяя предположить, что потеря экспрессии CCND2 является ранним событием в канцерогенезе.
Удержание клетки в G2-фазе осуществляется р53 через трансактивацию генов p21 и 14-3-3σ. Белок 14-3-3σ необходим для секвестрации комплекса cdc2-циклин В1 в цитоплазме, в то время как р21 может предотвращать активацию cdc2-циклин В1, поступающего в ядро. Гиперметилирование гена 14-3-3σ детектировано более чем в 90% случаев РМЖ и ассоциировано с потерей экспрессии. Интересно отметить, что у пациентов с РМЖ в гистологически неизмененных прилежащих тканях молочной железы также было показано гиперметилирование гена 14-3-3σ.
Гены, ответственные за апоптоз.
Ген ТР53 является геном-супрессором опухолей, локализованным на хромосоме 17р, и кодирует мультифункциональный ДНК-связывающий белок, вовлеченный в процессы блокады клеточного цикла, репарации ДНК, дифференцировки и апоптоза. Мутации ТР53 детектируются при многих типах опухолей человека и при ряде наследственных онкологических синдромов. Доля мутаций гена ТР53 при раке молочной железы несколько ниже, чем при других эпителиальных опухолях (от 15% до 45% по данным разных авторов) и их наличие ассоциировано с более агрессивным течением заболевания и снижением выживаемости. Гиперметилирование промотора нехарактерно для РМЖ, хотя и отмечено некоторыми авторами в единичных случаях.
[7] про гомеобоксные геныРегуляция синтеза р53 осуществляется белком HOXA5 путем его связывания с консенсусными последовательностями HOX-связывающих сайтов в промоторе ТР53. Для образцов РМЖ было показано скоординированное снижение уровня мРНК и белка р53 и HOXA5. Гиперметилирование промотора HOXA5 было выявлено в 16 из 20 р53-негативных опухолях молочной железы.
Для ряда генов, вовлеченных в стабилизацию р53, также показано аномальное метилирование. Метилирование промотора DAPK1 обнаружено в 7% случаев РМЖ, гиперметилирование гена TWIST в 21 случае из 50 инвазивных опухолей и в 4 из 14 карцином in situ.
Ген TMS1 относится к семейству сигнальных молекул апоптоза и функционирует как адапторный белок в фазе инициации апоптоза, путем взаимодействия с рецепторами клеточной гибели на поверхности клетки или активируя каспазный каскад. Аномальное метилирование TMS1, приводящее к потере экспрессии гена показано в 40% первичных опухолей РМЖ.
Ген FHIT участвует в регуляции клеточного роста, и возможно, вовлечен в клеточную пролиферацию и апоптоз. Метилирование CpG-островка, локализованного в промоторной области гена, выявляется при РМЖ и коррелируют с потерей экспрессии.
Гены, отвечающие за детоксикацию ксенобиотиков и репарацию ДНК.
Малигнизация является следствием каскадного накопления в геноме различных повреждений, приводящих к неконтролируемому росту клетки. В клетке существуют системы, которые отвечают за детоксикацию химических канцерогенов, и, следовательно, предотвращающие повреждение ДНК. Если же вследствие действия мутагенных факторов повреждение все-таки произошло, в работу включаются системы репарации, направленные на восстановление целостности ДНК. Таким образом, нарушения в генах, ответственных за детоксикацию и репарацию ДНК, могут приводить к малигнизации клетки.
Гены, входящие в семейство глутатион S-трансфераз (GSTs), отвечают за детоксикацию ксенобиотиков. Для гена GSTP1 показано метилирование промотора, ассоциированное с инактивацией гена, приблизительно в 30% первичных карцином молочной железы.
Одним из ключевых генов репарации, вовлеченных в канцерогенез при РМЖ, является ген BRCA1. Мутации этого гена ассоциированы с развитием семейных форм РМЖ. При спорадических опухолях молочной железы показано гиперметилирование промотора BRCA1, коррелирующее со снижением экспрессии гена, а также гипоацетилирование и конденсация хроматина в проксимальной области промотора. Следует отметить, что аномальное метилирование BRCA1 отмечается только в 11-13% спорадических случаев РМЖ, в то время как процент опухолей, характеризующихся снижением экспрессии этого гена значительно выше. Подобные наблюдения позволяют предположить наличие иных механизмов инактивации гена, в частности потерю гетерозиготности по данному локусу.
Гены, отвечающие за инвазию и метастазирование.
Неопластическая трансформация вызывает нарушения межклеточных контактов, что приводит к ослаблению связей между клетками. Причиной этих нарушений могут быть различные изменения в структуре и функциях генов, кодирующих молекулы межклеточной адгезии и (или) молекулы, участвующие в межклеточных контактах.
Семейство генов кадгеринов кодирует белки, расположенные на клеточной поверхности и принимающие участие в межклеточных контактах. Они являются ключевыми регуляторами клеточной пролиферации и дифференцировки опосредованно, через сигнальный путь катенин-транскрипционный фактор Lef/Tcf, воздействуя на активность ряда генов.
CDH1 – ген-супрессор, кодирующий Е-кадгерин, инактивация которого способствует приобретению опухолевой клеткой свойств инвазивности и метастазирования. Снижение транскрипции этого гена в результате метилирования его промоторной области обнаружено во многих опухолях человека, в частности, в первичных опухолях молочной железы и клеточных линиях РМЖ. В большинстве исследований была показана связь между потерей экспрессии Е-кадгерина и неблагоприятным прогнозом, кроме того, потеря экспрессии кадгерина отмечена как одно из фундаментальных нарушений при инфильтрирующей дольковой карциноме молочной железы.
Экспрессия H-кадгерина, кодируемого геном CDH13, значительно снижена в клеточных линиях РМЖ и опухолевых образцах. Метилирование CDH13 обнаружено в 33% первичных опухолей и 35% клеточных линий.
Тканевой ингибитор металлопротеиназы-3 (TIMP-3) является антагонистом активности матриксной металлопротеиназы и способен подавлять опухолевый рост, ангиогенез, инвазию и метастазирование. Метилирование TIMP-3 промотора выявлено приблизительно в 30% клеточных линий и первичных опухолей молочной железы.
Гены, ответственные за гормон- и рецепторопосредованную передачу сигнала.
Среди опухолей молочной железы можно выделить гормон-зависимые, отвечающие на гормональную терапию, и гормон-независимые, способные развиваться в отсутствие эстрогена.
Определение эстрогеновых и прогестеронового рецепторов используется в клинической практике как маркер прогноза заболевания и ответа на антиэстрогеновую терапию у больных РМЖ. ER/PR-позитивные опухоли являются, как правило, хорошо дифференцированными, содержащими диплоидный набор хромосом, имеют низкий уровень пролиферации и характеризуются отсутствием метастазов в лимфоузлах. ЭР/ПР-негативные опухоли, напротив, ассоциированы с агрессивным течением заболевания. Исследования, проведенные с использованием микрочипов, показали, что ряд генов в опухолевой ткани экспрессируется согласовано с ER-статусом опухоли.
Эстрадиол необходим для нормального развития молочной железы, а также для индукции и прогрессии рака молочной железы. Большинство эффектов эстрадиола опосредованно рецепторами эстрогенов. Ген эстрогенового рецептора α ESR1 (хромосома 6q25.1) содержит CpG-островок в промоторе и первом экзоне. Доказано, что метилирование промоторной области и первого экзона гена ESR1 играет роль в его инактивации. Использование ингибиторов метилтрансферазы приводит к восстановлению экспрессии гена. В нормальной ткани молочной железы и в ER-положительных клеточных линиях РМЖ метилирование этого гена не выявлено, в то же время в образцах РМЖ и ER-негативных клеточных линиях ESR1 метилирован в 50% случаев.
Функции недавно обнаруженного второго эстрогенового рецептора, ER- β, в клетках молочной железы еще недостаточно ясны, однако в ряде исследований показано, что метилирование гена ER-β является частым событием при РМЖ.
Ген PR кодирует две изоформы прогестеронового рецептора PR-A и PR-B, отличающиеся строением N-концевого домена и биологической активностью. Основным транскрипционным активатором экспрессии гена PR-B является эстрогеновый рецептор, поэтому уровень PR-B в клетке косвенно отражает функцию ER α. Метилирование PR-B показано в 40% ПР-негативных опухолей РМЖ и в некоторых ПР-негативных клеточных линиях.
Одними из ключевых компонентов, задействованных в регуляции роста и пролиферации нормальных и опухолевых клеток, являются ретиноиды, оказывающие как прямое, так и непрямое действие на экспрессию генов. Эффекты ретиноидов осуществляются посредством их воздействия на ядерные рецепторы ретиноидной кислоты (RAR-α, RAR-β, RAR-γ) и ретиноидные X-рецепторы (RXR-α, RXR-β, RXR-γ), которые относятся к суперсемейству рецепторов стероидных гормонов и являются лиганд-активируемыми транскрипционными факторами. Активация транскрипции происходит в результате связывания RAR/RXR-гетеродимеров или RXR-гомодимеров с ретиноид-зависимыми элементами (RAREs), локализованными в промоторных областях генов. Для большинства опухолей показано нарушение экспрессии RAR-β2, являющегося супрессором опухолевого роста. В частности, ряд авторов обнаружили аномальное метилирование промотора RAR-β2, ассоциированное с потерей экспрессии, в опухолях молочной железы.
Преимущества метилирования ДНК как молекулярного маркера канцерогенеза.
Анализ метилирования ДНК имеет ряд преимуществ перед детекцией мутаций при выявлении клеток рака в образцах тканей или свободной ДНК из опухолевых клеток в биологических жидкостях. Во-первых, частоты аномального метилирования CpG-островков множества генов значительно превышают частоты структурных повреждений тех же генов при канцерогенезе. Во-вторых, выявление аномально метилированных молекул ДНК в избытке нормального биологического материала не вызывает значительных проблем, детекция же мутаций/делеций в этой ситуации практически невозможна. В-третьих, анализ метилирования ДНК технически прост и в большинстве случаев сводится к ПЦР с одной парой праймеров. Поиск мутаций в одном гене требует использования от нескольких до нескольких десятков пар праймеров, кроме того, максимальная эффективность достигается только после секвенирования фрагментов ПЦР. Наконец, аномальное метилирование наблюдается в пренеопластических тканях и может служить одним из наиболее ранних маркеров канцерогенеза.
Преимущества аномального метилирования как молекулярного маркера способствовали поиску специфических эпигенетических изменений при РМЖ не только в тканях опухолей, но и в плазме крови и в протоковом аспирате, с целью разработки малоинвазивных диагностических тестов [4].
Аномальное метилирование ДНК в периферической крови при РМЖ.
Присутствие свободной ДНК из клеток злокачественных опухолей в плазме крови было доказано более 20 лет назад. Считается, что ДНК освобождается из опухолевых клеток в результате апоптоза и некроза. Несмотря на то, что количество свободной ДНК в плазме онкологических больных повышено, лабораторные исследования с её использованием возможны только при наличии четких маркеров повреждения ДНК, характерных для канцерогенеза. Единственным из таких маркеров, технически доступным для определения в плазме крови, на сегодняшний день является аномальное метилирование ДНК. Так, было обнаружено снижение метилирования гена ZNF217, входящего в группу генов-мишеней для эстрогенового рецептора-α и кодирующего транскрипционный фактор, который репрессирует гены, вовлеченные в процесс дифференцировки. Снижение метилирования ZNF217 коррелировало с повышенной биологической активностью эстрогенового рецептора-α. Это позволяет использовать снижение метилирования ZNF217 в качестве раннего маркера накопления эстрогенов. А их накопление, в свою очередь может служить индикатором риска возникновения рака молочной железы [8].
Поиск и характеристика новых эпигенетических маркеров канцерогенеза невозможны без применения современных методов анализа метилирования ДНК.
Использованная литература
1. Braiteh F, Soriano AO, Garcia-Manero G et al.: Phase I study of epigenetic modulation with 5-azacytidine and valproic acid in patients with advanced cancers. Clin. Cancer Res. 14(19), 6296–6301 (2008).
2. Flanagan JM, Munoz-Alegre M, Henderson S et al.: Gene-body hypermethylation of
ATM in peripheral blood DNA of bilateral breast cancer patients. Hum. Mol. Genet. 18(7), 1332–1342 (2009).
3. Issa JP, Kantarjian HM: Targeting DNA methylation. Clin. Cancer Res. 15(12), 3938–3946 (2009).
4. Kioulafa M, Kaklamanis L, Mavroudis D, Georgoulias V, Lianidou ES: Prognostic signifcance of RASSF1A promoter methylation in operable breast cancer. Clin. Biochem. 42(10–11), 970–975 (2009).
5. Sharma S, Kelly TK, Jones PA: Epigenetics in cancer. Carcinogenesis 31(1), 27–36 (2009).
6. Teschendorff AE, Menon U, Gentry-Maharaj A, Ramus SJ, Gayther SA, et al. 2009 An Epigenetic Signature in Peripheral Blood Predicts Active Ovarian Cancer. PLoS ONE 4(12): e8274.3.
7. Tommasi S, Karm DL, Wu X, Yen Y, Pfeifer GP: Methylation of homeobox genes is a frequent and early epigenetic event in breast cancer. Breast Cancer Res. 11(1), R14 (2009).
8. Widschwendter M, Apostolidou S, Raum E et al.: Epigenotyping in peripheral blood cell DNA and breast cancer risk: a proof of principle study. PLoS ONE 3(7), E2656 (2008).
|
